U.O. Anatomia Patologica

Esami biomolecolari basati su PCR

L’obiettivo principale dell’esecuzione di test molecolari basati su amplificazione genica mediante Reazione a Catena della Polimerasi o PCR è quello di fornire dati precisi e specifici sulle caratteristiche alterazioni genetiche, genomiche o cromosomiche dell’analita, allo scopo di coadiuvare il medico nella formulazione di una esatta diagnosi istologica, citologica o ematologica.

Le fasi procedurali per i test bio-molecolari basati su PCR sono:

  • Accettazione materiale, identificazione caso, numerazione
  • Verifica dell’idoneità del campione rispetto alle linee-guida
  • Pre-trattamento del campione
  • Estrazione degli acidi nucleici
  • Purificazione degli acidi nucleici
  • Quantificazione degli acidi nucleici
  • Allestimento dell’amplificazione genica (PCR o real-time PCR quantitativa) 
  • Elettroforesi in gel e sua acquisizione digitale
  • Inserimento diagnosi in computer e stampa del referto
  • Controllo e firma del referto scritto
  • Smistamento dei referti e preparazione delle buste per la loro consegna
  • Archiviazione del DNA non utilizzato, che viene conservato di norma a –20°C per un anno

Le tipologie principali di PCR impiegate nei test eseguiti sono le seguenti:

PCR single-step, semplice. E’ la reazione nella quale si impiega una singola coppia di primer, che vanno ad appaiarsi alle estremità della porzione di gene che si intende amplificare. Si usa ad esempio nella determinazione della traslocazione t(11;14) fra il gene Bcl-1 e la parte variabile delle catene pesanti delle immunoglobuline (IgH).

PCR double-step, semplice o multiplex. E’ la PCR che prevede due cicli, un primo per ottenere una certa quantità di prodotto atteso o da rilevare e un secondo, eseguito con primer disegnati all’interno del primo prodotto (“annidati”, da cui il termine nested PCR). Viene utilizzata ad esempio nella valutazione della clonalità linfocitica T e B e per la traslocazione t(14;18) IgH / Bcl-2.

PCR per la determinazione di mutazioni. E’ progettata in modo che i primer si leghino al DNA con modalità diverse a seconda della presenza o assenza di una sequenza specifica. Questa PCR è anche chiamata ARMS (Amplification Refractory Mutation System) e ne è un esempio applicativo la determinazione della presenza di mutazioni nel codone 617 del gene della Janus Kinase 2 (JAK-2) nelle malattie mieloproliferative croniche.

Real-time PCR quantitativa (qRT-PCR). Permette, oltre ad una valutazione di tipo qualitativo (presenza o assenza del gene target), anche una quantificazione del livello di espressione del gene stesso. Si basa sull’amplificazione selettiva del DNA copia (cDNA), retro-trascritto a partire dal pool di RNA messaggero (mRNA) del paziente. Questa metodica viene applicata nel nostro Laboratorio per la valutazione quantitativa della malattia residua minima nella Leucemia Mieloide Cronica, su RNA estratto da sangue periferico o midollare.

Per approfondire

http://it.wikipedia.org/wiki/Reazione_a_catena_della_polimerasi


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